技术专栏

KASP™ 技术在 SNP 基因分型方面的应用!

KASP™是指竞争性等位基因特异性PCR (Kompetitive Allele Specific PCR),可对广泛的基因组DNA样品,对目标 SNPs 和 InDels 进行精准的双等位基因分型,其准确率>99.8%(和一代测序结果相比),SNP 和 InDel 引物转化成功率高达 90%以上。

KASP因其超高的准确度和转化率、前所未有的低成本和高灵活性,被广泛用于作物和动物育种,在人类遗传病检测、药物基因组学、疾病易感性检测方面也发挥其独特的优势。随着基因分型技术在消费级市场的广泛应用,低成本、高通量、灵活、准确、多重检测的发展趋势,KASP技术及 LGC 特有高通量检测平台能够更好的满足市场需求。

一、KASP在人类上的应用

1、遗传病检测

许多遗传病由点突变或者碱基片段插入缺失导致,KASP基因分型技术可用于该类型的遗传病检测,如先天性耳聋、白化病、地中海贫血、苯丙酮尿症,家族性遗传性肾炎, 色盲,血友等。

(1)地中海贫血检测

我国南方部分省市20%人口携带地中海贫血基因。β型地贫可采用 KASP 基因检测。常用于夫妇双方孕前检测, 试管婴儿胚胎植入前遗传学诊断。

(2)耳聋基因检测

《孕期耳聋基因筛查专家共识(2022年)》指出:建议至少筛选孕妇基因组 DNA 中4个基因(即GJB2,SLC26A4,GJB3及线粒体MT-RNR1/12S rRNA)的20个变异位点。

博奥 - 二十三项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒

(微流控芯片法)

采用微流控芯片技术结合 竞争性等位基因特异性扩增技术(KASP) 对耳聋相关4个基因23种突变形式进行检测。

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2、药物基因组学(个体化用药)

全球每年死于不合理用药 750 万人。位居死亡人数排行的第四位。我国因药物不良反应住院的病人每年约 250 万人,直接死亡 20 万人。药物基因组学检测的位点数一般不超过 50 个,不适合采用 NGS 测序法。KASP 适用于少量位点的高通量检测,SNP 和 InDel 引物转化成功率高,是目前市面上最适合做药物基因组学检测的技术之一。KASP 基因分型可用于华法林、氯吡格雷、他汀类、硝酸甘油、高血压等的个体化用药解决方案。

3、疾病易感性检测

通过 KASP 基因分型检测,可以了解是否有易感风险,如心脑血管疾病、自身免疫性疾病或肿瘤等,可以帮助延缓疾病的发生、发展。KASP 利用其高度灵活性,可以适应消费者对不同检测项目的套餐组合的选择。其极低的成本,可以让易感基因检测被大众广泛接受。

(1)阿尔茨海默病 (AD) 风险基因检测

AD 的风险因素包括年龄、性别、睡眠、情绪、家族史、基因突变等,载脂蛋白 E (ApoE) 是目前研究最为深入且被广泛认可的易感基因。

阿尔茨海默病 (AD) 风险基因检测.png

如图所示,2个 SNP rs429358 和 rs7412,构成 6 种不同的基因型,携带 1 个 APOE ε4 风险增加约 3~4 倍,携带 2 个 APOE ε4 者增加约 10~15 倍。通过 KASP 基因分型检测,可以判断个体携带的基因型,从而预知风险,可进行早期干预。

通过以上3个部分可以看出,KASP 技术已经非常成熟,且应用相当广泛。除此之外,我们可以通过一些数据,更加直观地了解KASP技术至今为止所应用的领域。

KASP技术的应用在全球发表约3000篇、中国200余篇科技论文。植物方面涉及水稻、小麦、玉米等主粮作物的功能基因定位和分子标记辅助育种,还有花生、大豆、茶叶、中草药等。畜牧方面主要为牛、羊、驴等。人类医学研究包括糖尿病、结直肠癌、冠状动脉狭窄、动脉瘤、胃癌、听力丧失、阿兹海默、系统性红斑狼疮、关节炎等。

另外,我们还可以通过下图获悉,全球著名生命科学公司 LGC 利用 KASP 基因分型技术验证过的 SNP 位点:

KASP 基因分型技术验证过的 SNP 位点.png

二、SNP基因分型技术的发展方向与优势

1、消费级市场

基因检测会慢慢进入消费级市场。2016-2018 年消费级市场火热,之后热度褪去。新冠结束后,大量分子检测设备和实验室可用于消费级市场基因检测。所以,很多公司都在开发消费级市场的检测产品

2、低成本

随着国家集采,体外诊断公司也感受到前所未有的成本压力,降本是公司方向之一,大家都在寻找性能好,成本低的产品。

KASP 最主要的优点是采用通用荧光探针和淬灭基团,并提前预置于混合液中,根据检测位点设计普通的不需要特殊荧光修饰的引物,而不再需要针对每一个 SNP/Indel 位点设计昂贵的荧光修饰的探针,从而使检测成本大大降低,且引物设计合成难度也大大降低。

3、高通量、自动化

随着检测市场越来越大,应用越来越广,每天需要检测的样本量必定大大增加,这个时候就需要高通量、自动化平台。LGC 不同的高通量平台满足不同通量需求。其中SNPLine1536 平台每天可检测20万个数据。一体化IntelliQube 平台每天可检测2万3千个数据点。

4、灵活、快速、准确

此外基因分型会更加追求灵活、快速、准确。新冠之后大量的 qPCR 仪器闲置,KASP 技术非常灵活,可以应用于不同 qPCR 仪器。我们的检测基本可以在 2 个小时之内完成,并且准确率达到 99.8%。

与飞行质谱相比,飞行质谱需要采用预置芯片,灵活性要明显低于 KASP,一张芯片可对 384 可样本进行多重检测,由于是多重检测准确率为 95% 左右,低于 KASP。

5、多重检测

多重检测技术可分为多重荧光定量 PCR 技术、基于微流控的多重 PCR 技、基于固相载体的多重 PCR 技术。KASP 可以和微流控、固相载体技术结合,实现灵活的多重检测。

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