尿液样本常用于通过分子检测方法来检测定殖在生殖道中的细菌。但是,尿液中的低浓度细菌和像尿素和结晶这样的PCR抑制剂,会阻碍有效的DNA提取和后续的分子测试。本研究旨在开发一种优化的尿液处理方法,以提高检测生殖道细菌的DNA回收率。
什么原因导致尿液中DNA产量低下?
将尿液冷藏或冷冻会导致结晶的形成并沉淀出溶液。这些结晶在离心过程中形成沉淀块,会干扰DNA提取,导致产量下降。酸性的尿液pH会促进结晶的形成。加热尿液可以溶解结晶,但有DNA降解和细菌过度生长的风险。
如何逆转结晶的形成?
作者在12份有明显沉淀的尿液样本中,测试了添加生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)或Tris-EDTA来溶解结晶。与生理盐水或PBS相比,Tris-EDTA所需的体积最小,可以通过提高pH和螯合钙离子来完全溶解结晶。使用Tris-EDTA提取的细菌DNA产量明显更高。
Tris-EDTA是否可以提高多种细菌的提取效率?
在尿液样本中接种大肠杆菌和李氏乳杆菌,并比较有无加入Tris-EDTA处理的DNA回收率。两种菌的平均产量在经Tris-EDTA预处理的样本中显著增高。这表明了对不同细菌提取效率的改善。
这种优化方法在临床尿液样本中的表现如何?
应用10%体积的Tris-EDTA这一方案处理了998份男性尿液样本,细菌浓度在101至108个16S rRNA基因拷贝/mL尿液之间。9.1%的样本出现PCR抑制,但通过稀释DNA可以解决。非淋菌尿道炎患者的尿液细菌浓度明显更低,展示了这种提取技术的实用性。
结论
尿液冷藏过程中的结晶沉淀会降低来自生殖道细菌的DNA产量。在离心和提取之前使用少量Tris-EDTA预处理尿液,可以最大化细菌DNA的回收率,用于分子检测。这种高通量、有效的方法可以生成更高质量的尿液DNA。
参考文献
Munch MM, Chambers LC, Manhart LE, Domogala D, Lopez A, Fredricks DN, Srinivasan S. [Optimizing bacterial DNA extraction in urine.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6759279/) PLoS One. 2019 Sep 24;14(9):e0222962. doi: 10.1371/journal.pone.0222962. PMID: 31550285; PMCID: PMC6759279.
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