DNA 测序技术的最新进展使得能够使用独立于培养的技术来表征人体不同部位的微生物群落。使用这些方法的研究表明，尿道含有多种微生物种群，称为尿微生物组。泌尿微生物组的变化与尿路感染和盆腔疼痛综合征等泌尿系统疾病有关。然而，由于尿液中生物量低且存在 PCR 抑制剂，从尿液样本中提取 DNA 和测序仍然具有挑战性。许多研究表明，很大一部分尿液样本的 DNA 测序深度或回收率较差。本研究的目标是系统地优化专门针对尿液的 DNA 提取方案，以提高微生物 DNA 产量。
使用什么方法来优化 DNA 提取方案？
研究人员使用健康受试者的标准化尿液样本测试了对常用商业 DNA 提取试剂盒的多种修改。他们使用定量 PCR 和真菌特异性引物评估了每个步骤的真菌 DNA 产量。评估了以下参数：
（1）离心速度：1500、5000或16000 RCF
（2）酶消化：溶菌酶、裂解酶或两者一起分解细菌和真菌细胞壁
（3）机械破坏：用二氧化硅珠打珠
（4）热破坏：加热和冷冻循环
（5）蛋白酶 K 消化：浓度从 12 到 144 mAU/ml
（6）载体DNA的使用
（7）样品量：1至50毫升
（8）用于柱结合的样品等分试样大小：100 至 400 μl
（9）柱结合前合并等分试样
优化 DNA 提取方案产生了哪些关键结果？
（1）01500 RCF 的较低离心速度可获得最佳 DNA 产量
（2）溶菌酶和裂解酶联合消化可提高产量
（3）珠磨和热破坏步骤都很重要
（4）24 mAU/ml 蛋白酶 K 是最佳浓度
（5）添加载体 DNA 提高回收率
（6）25-30 ml 起始尿量可提供最大的微生物多样性
（7）以约 250 µl 的较小等份处理样品可提高产量
（8）柱结合前汇集等分试样可提高 DNA 回收率
与标准方法相比，优化方案的表现如何？
优化的 DNA 提取方案针对三种广泛使用的商业试剂盒进行了测试。与商业试剂盒相比，新方法显着提高了尿液样本中细菌和真菌 DNA 的产量，其中真菌产量增加了 200%。它还增强了阴道拭子中微生物 DNA 的回收率。下一代测序表明，与其他方法相比，优化的方案提供了更全面的真菌和细菌多样性表征。
开发改进的 DNA 提取方案有何意义？
这项系统优化研究确定了最大限度地从低生物量尿液样本中提取微生物 DNA 所需的关键修改。增强的方案可以更有效和更具代表性地表征尿液微生物组，包括尚未得到充分研究的真菌。通过提高微生物 DNA 产量和多样性，该方法可以帮助建立正常的尿液微生物特征并识别与泌尿系统疾病相关的变化。优化的 DNA 提取对于利用测序等独立于培养的技术来阐明尿液微生物组在健康和疾病中的作用至关重要。
参考文献
Ackerman AL, Anger JT, Khalique MU, Ackerman JE, Tang J, Kim J, Underhill DM, Freeman MR; NIH Multidisciplinary Approach to the Study of Chronic Pelvic Pain (MAPP). Optimization of DNA extraction from human urinary samples for mycobiome community profiling. PLoS One. 2019 Apr 25;14(4):e0210306. doi: 10.1371/journal.pone.0210306. PMID: 31022216; PMCID: PMC6483181.
文章为麦瑞科林原创，转载请注明文章链接和出处。
