技术专栏

倪晓平丨医院环境微生物标本采集与检验方法

讲者丨倪晓平(杭州市疾病预防控制中心)

整理丨雷晓婷(江苏省中医院)

审稿丨王玉兰(佛山复星禅诚医院)

来源丨2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会

倪晓平介绍.png

医院环境微生物采样监测是医院感染监测重要工作之一。通过环境微生物监测考核评价环境清洁与消毒质量;评价空气净化质量、环境物表的消毒效果等等;当怀疑医院感染暴发或疑似院感暴发与环境有关时,对环境卫生学的调查是不可或缺的,因此掌握正确的环境卫生学采集及检验方法非常必要,也是感控人的必修课。在2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会上,来自杭州市疾病预防控制中心倪晓平教授的《医院环境微生物标本采集与检验方法》精彩讲座,相信大家学习后对不同标本采集与检验方法会有更清晰的认识。

一、环境微生物采集的目的

考核环境清洁与消毒质量;

评价空气净化消毒效果;

评价环境表面消毒剂消毒效果;

调查与感染暴发的关系;

环境表面在传播病原菌作用的研究;

工程控制--表面材料的抗菌作用的研究。

环境微生物采集的目的不同,医院感染环境微生物检测的策略也不同。

二、环境微生物采集方法

(一)不同采样目的所遵循的规范要求不同

以考核清洁消毒质量为目的时,应按照既有规范的要求采样,如采样面积、采样工具(使用棉签涂抹法)等应符合规范要求。培养介质、实验条件、评价标准也应严格遵守规范,并做好阴性、阳性对照,进行微生物检测质量控制。

水标本尽量用蓝口瓶采集。如使用带软塞的试管,应配合酒精灯。采样器具放置在采样箱内携带转运,有条件的,试管架和其它采样器具分别放置。

必要时采样后的试管置于冰包内,以免检验前增菌。采样时采取必要的个人防护、做手卫生。

根据GB-15982《医院消毒卫生标准》,怀疑医院感染暴发或疑似暴发与医院环境有关时,应对各类环境空气、物体表面、工作人员手等进行目标微生物检测。如医务人员手、医疗器械、治疗用水、防护用品、消毒剂、消毒器械、污水的采样。

以调查环境与感染暴发的关系为目的采样时,可有多种方法:如海绵棒涂抹法(可以做大面积1m2采样)、平皿接触法(RODAC平皿)、载玻片接触法、薄膜粘贴法(用于可吸水的软质表面,如棉被、枕头、工作服等)。选用不同的采样工具,不限制采样面积,以尽可能捕捉到病原体。培养介质可以用选择性培养基,也可以增菌。

环境微生物采集方法.png

(二)目标细菌监测

杭州疾控中心曾对医院自测阴性的环境采样,结果发现:某市级医院ICU 环境表面MRSA阳性率100%,某省级医院NICU的环境MRSA阳性率50%。阳性率高的原因是,CDC使用了高分子材料采样拭子和MRSA选择性培养基。

高分子纤维拭子对环境表面细菌的吸附能力优于普通棉签,而针对特定病原菌的选择性培养基,较普通营养琼脂,更容易筛选出环境中一些非优势生长的致病菌。选择性培养基可选国产、进口产品,或自行配置。实验室要注意实验室生物安全。

目标细菌监测.png

疑似院感暴发调查:杭州CDC曾参与某医院ICU病房疑似医院感染暴发调查,采集环境标本121份,有菌落生长的环境表面有113份(93.4%),挑取750个菌落进行鉴定,鉴定出1种细菌的表面有30处(24.8%),最多的一处表面鉴定出8种细菌。而医院采样未见明显结果。时间成本上看,普通PCR培养需要7天以上,耗材3.5万元,高于MS。

杭州CDC曾参与某医院ICU病房疑似医院感染暴发调查.png

(三)采样时机的选择

采样时机也很重要。采样时应了解,环境表面最后一次清洁消毒是什么时候?是清洁前还是清洁后?清洁后多长时间?

日常监测,采样时机选择清洁后;如果做流行病学调查,应选择清洁前,还可以现场接种或进行增菌。

环境检测间隔时间.png

(四)日常监测注意事项

规范采样与实验;

针对性配制中和剂;

不得增菌、富集手段;

倾注培养、采样液剂量;

培养基,培养温度与时间;

微生物检测质量控制:

(1)培养基考核;

(2)阴、阳性对照;

(3)采样液富集(离心、膜滤、增菌等)。

(五)空气采样方法

空气采样方法有两种:被动采样和主动采样。

被动采样:自然沉降。基于采样区域空气中的颗粒物(细菌、真菌孢子)在重力作用下的自然沉降而将其捕获。对于粒径小、长时间悬浮空气中的病原体,可能无法获取。如,真菌孢子直径1~2微米,每小时沉降仅0.1~0.4米,被动采样捕捉到的概率就很小。

主动采样:动力抽气。基于动力风机抽气收集采样区域空气中颗粒物(细菌、真菌孢子)的采样方法。可决定采多大体积的空气。如单极空气采样器,仪器抽吸空气通过培养介质表面,通过控制采样时间调整采集样本的体积,可以在疑似污染源周围使用。

两级气溶胶采样器能将不同粒径颗粒物分层捕捉,获得不同大小颗粒物的阳性率。六级Andersen采样器,可对不同粒径的颗粒物进行捕获。

口罩采样:有人对口罩采样进行研究,感染患者佩戴含有滤膜的口罩,通过口罩滤过面来收集空气中的病原体。这种方法能连续收集标本,据报道,口罩标本中结核杆菌检出率(86%)明显高于普通痰标本(21%),作者认为口罩采样是连续收集标本,而痰标本除标本质量外,更关键的是某个“点”时间的采样。

(六)水源性微生物检测方法

检测目的:医疗机构用水主要是以城市自来水为基础,因水源污染造成的医院感染暴发已不鲜见,使用污染的水冲洗医疗器械,或用其洗手后进行侵入性操作,都可能增加感染风险。1990年至2012年文献报道医疗机构水源性医院感染暴发事件多达125起,因此,对水源性微生物检测非常重要。

微生物特点:

(1)微生物主要由碳元素构成,含量占菌体干物质质量的一半,其生长主要需要C、N、S等物质。微生物生长与繁殖所需要的环境温度有很大区别,如可以分为低温(22℃)、中温(36℃)、耐热(44℃)生长。

(2)按照细菌生长营养获取的方式,分为自养菌和异养菌。通常我们使用的培养温度在36℃左右(温度接近人体温度),如有菌生长,更多考虑病原菌来自人体。如果44℃条件培养阳性,应考虑为土壤环境细菌。如果22℃条件培养阳性,应考虑为水源环境细菌。

监测标准:

(1)目前,国际上对医疗机构用水的微生物监测方法缺乏统一标准。医疗机构用水微生物检测,执行GB/T 5750.12-2006《生活饮用水检验方法微生物指标》规定的菌落数检测方法,即水样在营养琼脂上,有氧条件下36℃±1℃培养48h后,所得的细菌菌落总数,标准为<100CUF/ml。检测的接种技术指定为倾注培养法。

(2)YY 0572-2015《血液透析及相关治疗用水》已开始关注环境污染菌的检测,要求采用常规的微生物检测方法获得细菌总数,首选薄膜过滤法,但不接受接种环法。可以参考采用《中华人民共和国药典(二部)》(2010年版)中规定的方法,或培养基选用胰化蛋白胨葡萄糖培养基(TGEA)、R2A或其它确认能提供相同结果的培养基,不能使用血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基,推荐17℃~23℃、168h(7d),针对环境菌的培养条件进行培养。

(3)我国和欧洲饮用水微生物检测标准比较,两者饮用水参照限值标准不同,美国EPA标准是<500CFU/ml,我国标准是<100CFU/ml。主要区别在于我国用营养琼脂(PCA),37℃培养2天,考虑的是检出人体污染菌;而欧洲标准使用R2A培养基,25℃培养7天,更多考虑环境污染菌。

(4)R2A培养基监测优势:

R2A培养基有低营养,碳源丰富的特点;与营养琼脂相比,更容易培养出环境细菌。

有研究对13家制药企业生产使用的制药用水卫生质量检测方法进行对比,结果显示,采用中国药典规定的检测技术,营养琼脂培养基,30~35℃,3d与玫瑰红钠琼脂培养基,23~28℃,5d,结果仅检出1家企业制药用水细菌超标。而采用欧洲药典的R2A培养基,培养条件30~35℃,5d,则有5家企业的制药用水细菌超标。

低营养(Low nutrition),但碳源丰富;低培养温度(Low temperature),延长培养时间(Long time),被称为水源菌“3L”微生物检测策略。这种策略更适合城市饮用水中污染菌的培养。但是,如前所述,日常监测仍然按照国家标准来采集和检测饮用水,36℃,48h,营养琼脂培养。

水源性微生物采样监测步骤:

日常监测时,可以先放水,再取样。如口腔科手机水先放水1min,漱口水先放水3杯,再采样50ml。

流调时,可以计算每段管路中水的体积,判断采到的水是哪一段,进行分段留取水标本。

使用蓝口瓶采样,则将水样过滤;无菌操作下将滤膜接种于平皿表面进行培养。

取1ml水样,加入倾注培养基;倾注培养基的缺点是细菌生长于琼脂中,无法进行细菌鉴定。涂抹法培养的菌落在培养基表面便于鉴定。涂抹法至少应250μL*4块平皿,合计总数。

感悟

倪晓平教授通过详细讲解环境微生物标本采集与检测方法,让我们更加认识和领悟到:微生物检测是考核院感的金标准。作为感控人关注日常消毒质量的考核要执行国家标准;减少常规环境表面细菌污染的监测;在感染暴发流调时采用一切可用的手段;重视采样用工具与培养技术的选择一样重要;分子实验的介入以提升循证等级。

一句话:重视与发展微生物技术,刻不容缓!

图文:王小虾

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