一、呼吸道病原学检测标本的采集方法
病原学检测标本的采集方法可分为非侵入性和侵入性,前者创伤小，患者易于接受，但容易受到上呼吸道定植菌群的污染；后者为有创性操作，从生理状态下"相对无菌"的部位取材，对诊断意义更大，其中组织活检标本是诊断肺部感染性疾病的金标准。应根据患者的临床情况选择最有效的采集方法，首先选择非侵入性方法（无创或微创检查），在非侵入性方法不能确诊时，在高度疑诊的情况下选择有创检查方法。应对标本采集者进行培训，并对所采集的标本进行质量控制，以提高标本的质量，减少假阳性和假阴性结果。呼吸道病原学标本的采集方法见表1[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。
二、标本的运送、储存与预处理
1．标本运送和储存原则：
（1）标本标签准确且申请单信息完整，应将标签贴在容器上，而非容器盖上[13,14]；（2）严格无菌操作[7]；（3）尽快送检标本，应在采样后2 h内送达实验室，样本量少的标本应于30 min内送检，避免标本干涸[7,15]；（4）对一些特定的病原体，应选择合适的方法对标本进行保存和运送，并及时进行检测。不同病原体检测标本的采集和转运原则见表2，不同类型标本采集量、保存和转运时间见表3。
2．针对不同病原体的检测方法：
标本采集后应及时进行质量控制，合格的标本应尽可能短期内送检。在临床工作中，除了常规检验外，还应结合患者的病史、临床表现、化验结果和影像学检查，有针对性地选择合适的检测方法对某些病原体进行检测。当临床预期和检测结果不相符时，应注意排除标本保存不当和检测方法选择错误等方面的因素。某些特殊病原体标本的转运、保存和检测方法见表4。
三、呼吸道病原检测方法的优缺点
不同检验方法的优缺点见表5[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]。在病原体培养和分离之后，对其进行体外药敏试验有助于进行针对性抗感染治疗。目前测定药物敏感度的方法主要有传统的药敏试验、自动化检测方法和分子生物学方法[30]。传统的药敏试验方法是表型体外试验，可直接测量细菌对抗菌药物的敏感度。自动化检测技术是在抗菌药物存在的情况下对细菌生长进行光学测定，通量高，比传统方法更加快速。也可以利用PCR等分子生物学方法直接对耐药基因进行检测，由于大多数细菌的耐药机制与多种因素相关，其基因型与表型通常并不完全相同，选择抗菌药物需综合分析决策。
四、病原检测结果的判读及其临床价值
病原学检查结果对临床治疗策略的选择具有指导意义，阴性结果有助于判断是否停用抗菌药物。病原学检查结果的判读应该综合考虑患者的年龄、基础疾病、免疫状态、临床特点、病情严重程度以及先期的抗感染治疗等情况。
（一）直接抗原快速检测
胶体金法病毒抗原快速检测方法简便、快速、成本低，与实时逆转录PCR比较，流感病毒抗原快速检测的敏感度为48.9%~59.8%，特异度为99.2%~99.7%[311:呼吸道合胞病毒抗原快速检测的敏感度为90%，特异度为98.8%[321,提示病毒抗原快速检测的特异性较好，但存在敏感度低、假阴性率较高的问题，这与鼻咽拭子标本病毒含量不稳定以及胶体金方法的敏感度较低有关[33]。故当临床高度怀疑为病毒感染，但病毒快速检测结果为阴性时，应加做病毒核酸检测，以排查假阴性[34]
除病毒外，抗原快速检测还可用于对真菌抗原(1,3-B-D-葡聚糖试验、半乳甘露聚糖试验)、细菌抗原(尿肺炎链球菌抗原)和非典型致病原抗原(尿嗜肺军团菌抗原)等的检测。和抗体检测不同抗原检测不受机体免疫状态的影响，但可能与药物和治疗方案有关，出现假阳性和假阴性结果，在临床工作中应结合患者的实际情况进行仔细分析。
（二）血清特异性抗体检测
某些致病的病原体在培养时所需条件高，生长周期长，阳性检出率低，检测特异性抗体在一定程度上可弥补这些不足。流感病毒、病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、嗜肺军团菌、肺炎支原体肺炎衣原体和结核分枝杆菌等病原体均有商用的抗体检测试剂盒对新型冠状病毒肺炎患者的检测也发现，在感染后3~5 d即可检测到病毒特异性IqM，而lgG抗体滴度在恢复期较急性期有4倍以上升高[35]。检测这些病原抗体具有速度快、特异度较高的特点，适合在门诊、急诊或基层医院用于病原体的筛查。但由于早期阳性率较低，需要采集急性期及恢复期双份血清进行检测和效果评价，但体液免疫缺陷的患者可呈假阴性。
（三）涂片
所获取的各种标本均应行病原学涂片检查。非侵入性检查获得的标本必须为合格标本，不合格标本常存在上呼吸道定植菌污染。在结果判读时，需要结合患者的临床症状和影像学表现，排除操作过程或环境污染的可能。BALF离心沉淀后行六胺银染色、抗酸染色和革兰染色可分别用来检测肺孢子菌、分枝杆菌和部分细菌等。肺穿刺标本和胸腔积液涂片发现病原体对确诊具有重要意义。
1．细菌：
(1)合格下呼吸道标本镜检可见典型革兰阳性柳叶刀样双球菌，如果每个油镜视野中肺炎链球菌超过10个对诊断有参考意义[36];分离到支气管炎博德特菌、土拉热弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌可以作为确诊依据[371:
(2)经气管导管吸引分泌物涂片革兰染色，若每个高倍镜视野检出2%以上白细胞有微生物吞现象，对病原学诊断有参考价值，可作为初始经验性抗感染治疗的依据[38,39,40,41,42,43];
(3)合格下呼吸道标本涂片镜检与培养结果一致(如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等)对诊断有重要参考意义[37];
(4)弱抗酸染色有助于奴卡菌的快影。
2．分枝杆菌：
痰涂片萋-尼抗酸染色和荧光染色法是诊断开放性肺结核的主要手段，但涂片镜检所见的抗酸杆菌并不能区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，荧光涂片镜检的敏感度高于萋-尼染色[44]。
3．真菌：
呼吸道标本涂片发现真菌孢子或菌丝时，应结合患者的临床特征，基础疾病、免疫状态及其他标本病原学检查结果综合判断是定植还是感染。念珠菌是口腔常见的定植菌,涂片发现念珠菌假菌丝和出芽孢子时应排除口腔局部定植或感染[45]。
呼吸道标本发现曲霉或毛霉丝时临床意义较大，合格痰标本、气管内吸引物、BALF或刷检标本镜检发现较为特异的菌丝可作为诊断肺曲霉病、毛病的微生物学依据，但涂片阳性率远低于培养阳性率[36,46]。
检测肺孢子菌最常用的是六胺银染色和免疫荧光染色法，BALF或诱导痰镜检发现病原体可作为肺孢子菌肺炎的确诊依据。黏蛋白卡红染色可用于发现隐球菌，但不能作为隐球菌肺炎的诊断依据。下呼吸道标本涂片相差显微镜镜检是诊断皮炎芽生菌肺炎、粗球孢子菌肺炎、新型隐球菌肺炎及曲霉肺炎的重要手段之一。总之，相对真菌培养而言，涂片检查是对真菌感的快速、初步、有效的诊断方法[3℃」
4．寄生虫：
涂片镜检发现寄生虫虫体、虫卵、滋养体、包囊或卵囊可作为确诊依据。直接涂片镜检可发现并殖吸虫虫卵、阿米巴原虫滋养体，吉姆萨染色可发现刚地弓形虫滋养体或包囊，改良抗酸染色可发现隐孢子虫卵囊，改良三色染色法可发现比氏微孢子虫[13,47]。
（四）培养
在进行痰培养前必须确定是合格痰标本，并排除操作不当或环境污染的情况。定量培养有助于区分致病菌和定植菌。
1．细菌：
（1）痰定量培养的细菌浓度≥107 cfu/ml、经气管内吸取物细菌培养浓度≥105 cfu/ml、BALF培养细菌浓度≥104 cfu/ml或保护性毛刷标本细菌培养浓度≥103 cfu/ml时，致病菌的可能性较大[48,49,50]；
（2）胸腔积液、肺活检标本培养到病原菌[13]，下呼吸道标本培养出支气管炎博德特菌、土拉热弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌可作为确诊依据[37]。
2．分枝杆菌：
培养结果可鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，并有利于体外药敏试验。但结核分枝杆菌培养耗时长、操作复杂，对实验室生物安全要求较高，应结合核酸检测如GeneXpert检测结果进行判断[44,51]。
3．非典型病原体：
下呼吸道标本分离培养阳性可以确诊，但耗时长，阳性率偏低，通常通过血清特异性抗体、核酸检测等方法诊断。
4．呼吸道病毒：
标本进行细胞培养时出现细胞病变效应或培养细胞表面出现血细胞凝集抗原提示病毒阳性。但因其培养耗时长，阳性率偏低，不建议常规应用，多通过血清特异性抗体、核酸检测等方法诊断[36]。
5．真菌：
肺组织活检标本培养阳性是诊断真菌感染的重要依据，但应注意排除污染的可能。即使是下呼吸道分泌物、BALF也需除外定植或污染。痰培养念珠菌阳性难以区分定植或感染,临床意义有限,即使保护毛刷标本培养阳性也不能作为诊断侵袭性肺念珠菌病的依据，但如果痰、诱导痰或BALF标本镜检时发现大量出芽菌体和念珠菌菌丝提示念珠菌处于快速繁殖期，具有一定的临床指导意义[45]。
痰标本培养连续2次分离到同种曲霉及BALF单次培养阳性可作为诊断肺曲霉病的微生物学依据[52]。
[隐球菌培养阳性可以作为诊断的重要参考依据，由于新型隐球菌可以寄生于健康人群,应结合临床具体情况判断是否为感染，对人免疫缺陷综合征或其他免疫抑制患者有参考价值[45,53]。
目前肺组织胞浆菌病确诊标准应为组织学和微生物学检查同时发现该菌[53]。
临床标本分离培养出马尔尼菲青霉是诊断该病会诊的金标准[54]。
（五）核酸分子扩增检测和基因芯片检测
与传统方法相比较，核酸分子扩增和基因芯片检测具有以下优势：
（1）方法简单、快速、高效，敏感度和特异度均较高，能为临床早期诊断提供依据，尤其对一些需要长时间培养（如结核分枝杆菌）或无法体外培养（如病毒）的病原体，更适合采用分子诊断技术进行检测。在新近发生的新型冠状病毒肺炎疫情中，实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性已经作为确诊病例的病原学诊断标准之一[35,54]。（2）目前的分子诊断技术可以一次性检测多种病原体，有助于快速筛查病原。
（3）目前研发的耐药基因检测有助于制定临床决策[55,56,57]。
但分子检测技术也存在不足：
（1）多重PCR使用多对引物同时扩增时，可能出现引物间相互干扰，影响其敏感度和特异度，造成假阴性或假阳性；
（2）核酸检测阳性结果需结合临床实际情况，分析究竟是定植菌还是致病菌。
目前，我国自主研发的环引物介导的等温扩增微流控芯片体系，有机结合了核酸分子扩增和基因芯片技术，应用加样后自动封闭式的独立分隔多重扩增，在提高诊断率的同时，降低和避免了常规核酸扩增引起污染的可能，现已广泛应用于临床病原的检测[58]。
