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淋球菌感染的实验室诊断方法:分离培养

1 培养基 

分离淋球菌一般选用营养丰富的选择性培养基。常用的选择性培养基有改良的Thayer-Martin (T-M) 培养基、含抗生素的血液琼脂或巧克力琼脂培养基。可购买商品化的培养基或实验室自配,培养基应密 封在塑料袋中,于4℃冰箱贮存,贮存时间不应超过3周,时间过久则分离率降低。分述如下: 

1.1  Thayer-Martin(T-M)培养基 

1) 成分。包括 GC 基础培养基,血红蛋白粉,VCNT 抑菌剂(含万古霉素、多粘菌素、三甲氧 苄胺嘧啶和制霉菌素),Iso-Vitalex 增菌剂。 

2) 配制方法。以配制 500 mL 培养基为例,步骤如下: 

● 称取 GC 琼脂粉 18 g,置一烧瓶中,加 235 mL 蒸馏水,摇匀后置沸水浴 15 min~30 min, 使琼脂完全溶解; 

● 称取血红蛋白粉 5 g,加于乳钵内,用 250 mL 蒸馏水分次研磨溶解后,置沸水浴 15 min~ 30 min; 

● 将上述两种溶液置于 121℃高压灭菌 15 min,冷却至 50℃,在无菌条件下将血红蛋白 溶液缓慢加入到琼脂液内,弃去可能存在的血红蛋白沉渣; 

● 取 1 小瓶 Iso-Vitalex 增菌剂,用所附的一小瓶稀释液溶解后加入到步骤 3 所配的混 合液中,边加边摇; 

● 取一小瓶 VCNT 抑菌剂,用 5 mL 无菌蒸馏水溶解后加入到步骤 4 所配的混合液中,边 加边摇; 

● 在无菌条件下将配好的培养基分装入无菌平皿中,待凝固后,用塑料袋封存,置 4℃ 冰箱保存备用。

1.2  GC 血液琼脂培养基 

1) 成分。包括 GC 基础培养基和脱纤维羊血。 

2) 配制方法:以配制 500 mL 培养基为例,步骤如下: 

● 取 GC 琼脂粉 18 g,置一烧瓶中,加 450 mL 蒸馏水,摇匀后置沸水浴 15 min~30 min, 使琼脂完全溶解; 

● 将 GC 琼脂溶液置于 121℃高压灭菌 15 min,冷却至 50℃;

● 在无菌条件下将 50 mL 脱纤维羊血(羊血在临用前置 37℃水浴预热)加入到琼脂溶液 中,摇匀后分装于无菌平皿中,待凝固后,置塑料袋封存,置 4℃冰箱保存备用。 

1.3 Amies运送培养基(含活性炭)

amies活性炭-参数.jpg

1) 成分。活性炭 5 g,氯化钠(NaCl)1.5 g,磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.575 g,磷酸二氢钾 (KH2PO4)0.1 g,氯化钾(KCl)0.1 g,硫代乙酸钠 0.5 g,氯化钙(CaCl)0.05 g,氯化镁 (MgCl)0.05 g,琼脂 2 g,蒸馏水 500 mL。 

2) 配制方法:以配制 500 mL 培养基为例,步骤如下:

● 将各种成分加到 500 mL 蒸馏水中,充分混合; 

● 121℃高压灭菌 15 min,冷却至 50℃,然后分装于小管中,每管 6 mL。在分装时,不 时摇动混匀琼脂,以使活性炭末处于均匀混悬状态;

● 置 2℃~8℃可储存 6 个月。 

2 接种标本

取材后标本应尽可能及早接种。培养基应先置于室温中预温。将取材的拭子转动涂布于平皿的上1/4 范围,然后用接种环分区划线,以保证获得较纯的单个菌落。 

3 培养条件 

接种标本后,立即将平皿置于(36±1)℃,含5%~10% CO2,湿润(70%湿度)的环境中培养。淋 球菌为需氧菌,但初代分离需要CO2 。CO2环境可由CO2培养箱、CO2产气袋或烛缸提供。使用烛缸时,应使用白色、无芳香味的无毒蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。 

4 观察结果 

培养24 h后检查平皿,此时没有菌生长的平皿应继续培养至72 h,仍无菌生长才可丢弃,做出淋球菌培养阴性的报告。因为某些菌株,如AHU-营养型菌株生长缓慢,且菌落小。如果培养时间不足72 h, 它们可能会被忽略。对选择性培养基上分离的可疑菌落应做进一步鉴定。

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