CRISPR技术在病毒检测领域在这三年新冠疫情大放异彩。Sherlock Biosciences的Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit是首个获得FDA EUA认证的应用CRISPR技术的新冠检测产品，于2020年5月获得批准。除了Sherlock Biosciences，还包括Stanford University、Tunlane University、Caspr Biotech、Mammoth Bioscience等机构，已经开发了应用CRISPR技术的SARS-CoV-2测试。
CRISPR技术已在HIV上检测和治疗上已有巨大突破，不过近期，康涅狄格大学的研究团队在ACS Nano上发表的研究《Bioinspired CRISPR-Mediated Cascade Reaction Biosensor for Molecular Detection of HIV Using a Glucose Meter》中受到CRISPR技术的启发，开发了一种低成本的供电的生物传感器，用于使用类似于糖尿病家庭测试的简单个人血糖仪进行HIV病毒的定点检测。
艾滋病是世界上最严重的公共卫生挑战之一。根据UNAIDS（联合国艾滋病规划署）最近的一份报告，强调了艾滋病毒项目进展缓慢，2021年约有150万新增感染病例，超过全球目标100万。
分子检测在艾滋病毒患者的早期诊断和病毒治疗中发挥着重要作用。目前艾滋病毒检测的金标准RT-qPCR需要昂贵的仪器和受过训练的实验人员来操作。因此在对快速、灵敏和低成本的艾滋病毒分子检测方法的需求还有很大的空间。
在美国，快速便捷的HIV检测也在最近获得了新发展。2月18日，Chembio Diagnostics的DPP HIV-Syphilis System POCT产品在美国获得FDA的CLIA豁免。届时，美国将会有超过200,000家CLIA豁免的POC检测点现在可以使用该系统检测HIV和梅毒。
图片
本文主要介绍的研究中，研究团队表示受活细胞内多区室结构的启发，提出了一种膜分离、微流体、CRISPR供电的级联反应系统。通过与葡萄糖生物传感技术相结合，它被开发成一种便携式、一次性诊断平台，用于HIV病毒和其他病原体的分子检测。
CRISPR技术是对不同病原体进行高灵敏度和特异性核酸分子检测的前沿技术。当与简单的等温扩增技术一起使用时，它是一种强大的诊断工具。然而，等温扩增反应和CRISPR检测系统的组合能力有限，需要单独的反应管和多个手动操作，增加了污染的风险，不适合简单和有效的POC应用。
为了提高兼容性，研究人员提出了一种纳米多孔膜分离的级联反应系统，并将其集成到一个简单、便携式的CRISPR介导的级联反应（MCR）生物传感器中，用于HIV核酸检测，该生物传感器使用低成本的血糖仪。该传感器也利用了Recombinase polymerase amplification（RPA）反应的技术，该技术是一种高灵敏度的选择性等温扩增技术。
▲图：RPA放大反应。
重组酶蛋白与每个引物形成复合物（A），后者扫描DNA以寻找同源序列（B）。然后通过重组酶的链置换活性（strand-displacement activity）将引物插入同源位点（C），单链结合蛋白稳定置换的DNA链（D）。然后重组酶分解，使引物的3′端可被链置换DNA聚合酶（E）所接触，从而延长引物（F）。核酸片段的放大是通过循环重复这个过程实现的。
在CRISPR介导的级联反应系统中，多孔膜将反应系统分成两个反应室：（i）下部RPA/RT-RPA反应室和（ii）上部CRISPR反应室。在HIV病毒核酸的存在下，由于DNA的指数扩增，在Recombinase polymerase amplification（RPA）反应室中产生数百万RPA扩增子。由于浓度梯度（差异）和小分子尺寸，这些短扩增子（137bp）可以容易地通过纳米多孔膜扩散到CRISPR反应室中，这导致CRISPR反应室内CRISPR-Cas12a酶的特异性激活。
激活的CRISPR Cas12a非特异性地切割固定在磁珠上的单链DNA（ssDNA）结合的转化酶，导致释放游离转化酶用于下游电化学检测。
A）在5、15和30分钟的不同催化反应时间后，使用葡萄糖计在生物传感器中检测HIV DNA。
B）在10和20分钟的催化时间后，使用葡萄糖计在生物传感器中检测HIV RNARPA放大反应。
研究人员能够在每次测试中检测到43份HIV DNA病毒拷贝数和200份HIV RNA病毒拷贝数的敏感性，显示出在POCT快速检测HIV病毒和其他传染病的巨大潜力。
